专利公布号：CN106318930A

　　申请人：华南理工大学

　　发明人：王永华蓝东明张泽栋杨博周鹏飞

　　提供一种以高温酯酶TTEST为主的复合酶制剂去除废纸浆中胶黏物的方法。

　　步骤如下：

　　(1)高温酯酶TTEST的制备：

　　将酯酶TTEST菌种接种到种子液体培养基振荡培养，再将菌种接种到发酵培养基振荡培养，制备得到高温酯酶TTEST粗酶液，将高温酯酶TTEST粗酶液纯化，用对硝基苯酚比色法测定高温酯酶TTEST的酶活。

　　利用全基因合成方法获取的TTEST酯酶的编码基因，并克隆到表达载体pET23a-CBD载体上获得重组表达载体。利用CaCl2转化法，将含有TTEST酯酶编码基因的表达质粒转入BL21(DE3)菌种中，获得基因工程菌。将酯酶TTEST的菌种接到含Amp(100ug/ml)的LB种子培养基中扩大培养，当OD值达到0.6～0.8时，将菌液按照1:100的比例接种到含Amp(100ug/ml)的LB发酵培养基中，摇至OD值为0.6～0.8时加入IPTG(20mmol/L)诱导剂进行诱导表达，18～24h后收菌。将菌液在12000r/min条件下离心10min后收集管壁细胞进行超声破碎，之后再以12000r/min条件离心10min后取上清液，即得到粗酶液。利用纤维素与酯酶进行特异性结合，之后再用3C蛋白酶进行酶切从而得到纯酶。1L菌液对应1g纤维素，常温下将粗酶液与纤维素结合30min，适时搅拌。结合后高速离心10min，弃去上清液，将吸附蛋白用PBS缓冲液洗两次。3C蛋白酶在使用前先离心、弃去上清，利用PBS缓冲液清洗2次。向吸附蛋白中加入适量PBS，按1L菌液对应1ml3C蛋白酶的比例混匀后酶切4h或过夜。酶切后高速离心，上清液即为纯酶。之后利用对硝基苯酚比色法测定制备的高温酯酶TTEST的酶活，测得酶活为3500U/g。脂肪酶CALB为商品化脂肪酶，测得酶活为150.0U/ml。

　　(2)按照质量百分数计，将高温酯酶TTEST(45%～50%)与淀粉酶(15%～20%)、果胶酶(10%～15%)、木聚糖酶(10%～15%)、甘油(5%)、聚乙二醇(5%)、水(5%～10%)复配成复合酶制剂。

　　(3)称取100gOCC绝干浆，稀释到相应浆浓，添加一定量的酶，在一定的处理温度、pH值、处理时间、搅拌转速下(如表1)，按照TAPPIT-277胶黏物测定法利用Pulmac-MasterScreen筛分仪将浆料进行筛选，之后将筛出的胶黏物进行染色、压片，最后用扫描软件进行分析扫描，进而测得酶处理后的胶黏物含量。

　　在不加酶的情况下，用其余相同条件处理废纸浆，实验测定结果为空白组胶黏物含量。

　　复合酶制剂的添加量为废纸浆绝干浆质量的0.1%～1.0%，处理温度为40～80℃，处理时间45～120min，pH为6.0～9.0，搅拌转速为100～150r/min。

　　复合酶处理废纸浆的温度为50～55℃，复合酶处理废纸浆的搅拌条件为120r/min，反应时间为60min。复合酶的添加量为废纸浆绝干浆质量的0.3%～0.5%。复合酶处理废纸浆的pH为7.0～8.0。废纸浆的浆浓为4%～6%。

　　高温酯酶的酶活为3500U/g。淀粉酶酶活为5000U/g，果胶酶酶活为5000U/g，木聚糖酶酶活为10000U/g。

　　在40～55℃条件下，加入复合酶处理后的废纸浆中胶黏物含量明显减少，胶黏物去除率可达60.8%～74.1%，要明显优于脂肪酶CALB的去除效果。即使在80℃高温条件下，加入复合酶后的处理效果也较为理想，废纸浆中的胶黏物去除率达到58.5%，而脂肪酶CALB在此条件下基本失活，难以去除胶黏物。考虑到废纸造纸过程中不同工段的温度不尽相同，酯酶PCEST在废纸回收不同工段中去除胶黏物的效果都较为理想。

　　与现有技术相比的有益效果：

　　(1)高温酯酶TTEST制备较为容易，效果明显。

　　(2)复合酶制剂可以应对废纸回收工艺中的各种高温以及酸碱环境，在高温条件下仍能保持较好的胶黏物去除效果。

　　(3)通过以高温酯酶为主的复合酶制剂去除废纸胶黏物的方法可直接在生产线上进行，无须增加任何机械设备，操作简单，成本低。

　　因此，通过以高温酯酶为主的复合酶制剂控制废纸浆中的胶黏物的方法高效、稳妥地解决了过去在废纸造纸领域严重影响产品质量胶黏物问题，具有操作简单、去除效果显著、生产成本低、无污染等优点。